Histological characterization of reproductive tract and fetal annexes of the West Indian Manatee (Trichechus manatus) from Brazil / Caracterização histológica do trato reprodutor e anexos fetais do peixe-boi marinho (Trichechus manatus) do Brasil

The West Indian manatee (Trichechus manatus) is one of the most threatened aquatic mammals in Brazil, and is currently classified as "endangered" (MMA). The objective of this study was to characterize histologically the reproductive tract and fetal annexes of stranded manatees in northeastern Brazil. Tissue samples were collected from the reproductive tract of 23 manatees, which were fixed in 10% buffered formalin, processed using standard histological protocols and stained with hematoxylin eosin. We qualitatively described the histological and histomorphometric characteristics of each structure. Six ovaries were analyzed. In four ovaries, we found a large number of primordial and primary follicles. Two ovaries were different from the others: one had inflammatory infiltration and the other had a thickening in the cortex and absence of follicles. We also analyzed seven uteri (of which four were in the proliferative phase, two in the secretory phase, and one in the recovery phase), four placentas, one vagina, six testes (four were in the immature phase, one in the pubertal phase, and one in the mature phase), two epididymides, two penises, and one umbilical cord. The histological and morphometric findings in our work will support future analyses of the reproductive tract of T. manatus from Brazil.(AU)

O peixe-boi marinho (Trichechus manatus) é um dos mamíferos aquáticos mais ameaçados do Brasil e, atualmente é classificado como "em perigo" (MMA). O objetivo deste estudo foi caracterizar histologicamente o trato reprodutor e os anexos fetais de peixes-bois marinhos encalhados no Nordeste do Brasil. Foram coletadas amostras de tecidos do trato reprodutor de 23 peixes-bois marinhos (T. manatus), que foram fixadas em formol tamponado a 10%, processados usando protocolos histológicos padrão e corados com hematoxilina eosina. Foi realizada a descrição qualitativa das características histológicas e histomorfométricas de cada estrutura. Foram analisados seis ovários. Em quatro ovários, foi encontrado um grande número de folículos primordiais e primários. Dois ovários eram diferentes dos outros: um tinha infiltração inflamatória e o outro tinha um espessamento no córtex e ausência de folículos. Também foram analisadas sete amostras uterinas (das quais quatro estavam na fase proliferativa, duas na fase secretória e uma na fase de recuperação), quatro placentas, uma vagina, seis testículos (quatro na fase imatura, um na fase puberal e um na fase madura), dois epidídimos, dois pênis e um cordão umbilical. Os achados histológicos e morfométricos em nosso trabalho apoiarão futuras análises do trato reprodutivo de T. manatus do Brasil.(AU)

Isolation, culture, characterization and cryopreservation of stem cells derived from amniotic mesenchymal layer and umbilical cord tissue of bovine fetuses / Isolamento, cultura, caracterização e criopreservação de células tronco derivadas de camada amniótica mesenquimal e de tecido do cordão umbilical de fetuses bovinos

Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell types, in both human and veterinary fields, are the mesenchymal stem cells (MSC) derived from bone marrow and adipose tissue. Nowadays, there is a great interest in using stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM) and umbilical cord tissue (UCT), which can be obtained non-invasively at delivery time. Due to the scarcity of studies in bovine species, the aim of this study was to isolate, characterize, differentiate and cryopreserve MSC derived from the mesenchymal layer of amniotic membrane (AM), for the first time, and umbilical cord tissue (UCT) of dairy cow neonates after assisted delivery (AD) and from fetus at initial third of pregnancy (IT) obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0.1% collagenase solution. Six samples of AM and UCT at delivery time and six samples of AM and UCT at first trimester of pregnancy were subjected to morphology evaluation, imunophenotype characterization, in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation and viability analysis after cryopreservation. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, did not or low expressed CD 34 (AM: IT-0.3%a, AD-3.4%b; UCT: 0.4%, 1.4%) and MHC II (AM: IT-1.05%a, AD-9.7%b; UCT: IT-0.7%a, AD-5.7%b). They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80% viability after cryopreservation. According to the results, bovine AM and UCT-derived cells, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell banking.(AU)

As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação. Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. As células tronco mais utilizadas, tanto na medicina humana como na medicina veterinária são as células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea e do tecido adiposo. Atualmente, uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (TCU) e sangue do cordão umbilical (SCU) pode ser observada, já que estas fontes podem ser colhidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA e TCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e de fetos do terço inicial da gestação em abatedouro-frigorífico. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e TCU no momento do parto (n=6) e de MA e TCU no terço inicial de gestação (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológicas, imunofenotípica por imunocitoquímica e citometria de fluxo, diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e ainda, avaliação da viabilidade após a criopreservação por citometria de fluxo. Todas as amostras dos diferentes grupos demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para ou baixíssima expressão de CD34 (MA: TI-0,3%a, PA-3.4%b; TCU: TI-0,4%, PA-1.4%) e nula ou baixa expressão de MHC II (MA: TI-1.5%a, PA-9.7%b; UCT: TI-0.7%a, PA-5.7%b. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas pós criopreservação por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram viabilidade de 80%. Estes resultados indicam que MA e TCU, obtidos tanto no momento de parto como em abatedouro, de fetos bovinos podem ser utilizados como fonte não invasiva e indolor de CTMs e possibilitam a formação de bancos de armazenamento de células.(AU)

Correlação entre o peso, comprimento e anexos fetais de mocós (Kerodon rupestris Wied, 1820) / Correlation between weight, length and fetal membranes of rock cavies (Kerodon rupestris Wied, 1820)

Foi avaliada a existência de correlação entre diferentes anexos fetais de mocós e determinada a relação entre peso do feto e peso da placenta, a relação entre o peso do feto e comprimento do cordão umbilical e a relação entre o peso do feto e comprimento do feto. Foram utilizados anexos fetais e fetos de três, cinco e seis fêmeas, respectivamente, no terço inicial, médio e final de gestação, obtidas no Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS-UFERSA). Os dados foram expressos em média ± desvio-padrão, bem como valores mínimos e máximos, avaliados pelo programa estatístico GraphPad Prism Versão 6.0. Após a análise dos pressupostos paramétricos, os dados foram submetidos aos Testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, e regressão linear. A relação entre peso do feto e peso da placenta demonstrou expressão y = 33,73 + 16,38x com cálculo do coeficiente de correlação entre o peso do feto e o peso da placenta elevado e positivo, evidenciando dependência entre as variáveis (R2 = 0,7251). A relação entre o peso do feto e comprimento do cordão umbilical demonstrou expressão y = 35,64 + 25,64x e a análise de correlação entre as variáveis, positiva (R2 = 0,7201) indicando elevada dependência entre as variáveis. Quanto à relação entre o peso do feto e comprimento do feto, identificou-se uma relação do tipo y = a + bx, cuja expressão definida foi y = 1,26 + 0,41x, com análise de correlação das variáveis apresentando elevada correlação considerando-se o valor de R2 = 0,7890. As variáveis analisadas demonstram uma influência direta no desenvolvimento embrionário e fetal em mocós confirmando a correlação destes com o tamanho do feto.

We evaluated the correlation between different fetal membranes of rock cavies and determined the relationship between fetal weight and placental weight, the relationship between fetal weight and length of the umbilical cord and the relationship between fetal weight and length of the fetus. The fetuses and fetal membranes of three, five and six females respectively in the first third, middle and late gestation were used, obtained from Multiplication Center for Wild Animals of the Federal University Rural of Semiarid (CEMAS-UFERSA). The data were expressed as mean ± standard deviation, minimum and maximum values, evaluated by the statistical program GraphPad Prism version 6.0. After analysis of parametric assumptions, the data were subjected to Kruskal-Wallis’ test and Mann-Whitney’s test and linear regression. The relationship between fetal weight and placental weight showed the expression y = 33.73 + 16.38x with an estimate of the coefficient of correlation between fetal weight and placental weight high and positive, showing dependence between variables (R2 = 0.7251). The relationship between fetal weight and length of the umbilical cord showed expression y = 35.64 + 25.64x and the correlation analysis between variables, positive (R2 = 0.7201) indicating high dependence between variables. Regarding the relationship between fetal weight and length of the fetus, we identified a relationship of the type y = a + bx, whose expression was defined y = 1.26 + 0.41x, with correlation analysis of the variables showing high correlation considering the value of R2 = 0.7890. The variables analyzed demonstrate a direct influence on embryonic andfetal development in rock cavies confirming the correlation of these with the size of the fetus.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais do líquido amniótico equino obtido em diferentes idades gestacionais / Isolation, characterization and differentiation of mesenchymal stem cells derived from equine amniotic fluid obtained from different gestacional ages

O interesse nas pesquisas com células-tronco derivadas de anexos fetais de diversas espécies cresceu exponencialmente nas últimas décadas em virtude de serem fontes de células-tronco adultas com potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares que apresentam pouca ou nenhuma imunogenicidade, apresentando-se assim como alternativa de grande importância para a formação de bancos celulares. Apesar do crescente interesse, os estudos para espécie equina ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico equino obtidas do terço inicial, médio e final da gestação (LA-CTMs), comparando suas características. Foram colhidas 23 amostras de líquido amniótico as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e às diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Todas as amostras demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico as células de todos os grupos foram imunomarcadas para CD44, PCNA e vimentina com ausência de marcação para citoqueratina e Oct-4. Na citometria de fluxo observou-se a expressão de CD44 e CD90 e ausência de expressão de CD34, sendo que os marcadores CD44 e CD90 mostraram padrão de expressão decrescente em relação ao desenvolvimento gestacional. As amostras obtidas de todas as fases da gestação foram capazes de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. Portanto, as células obtidas do líquido amniótico apresentaram características morfológicas, imunofenotípicas e potencial de diferenciação típicos das CTMs, demonstrando que a colheita pode ser realizada em qualquer fase gestacional. No entanto, mais pesquisas devem ser realizadas principalmente quanto à expressão de marcadores de pluripotencialidade (como o Oct-4) e ao seu potencial de diferenciação em linhagens extra mesodermais já relatados na literatura.

The interest in stem cells derived from fetal annexes of many species has exponentially increased during the last decades, because they are adult stem cell sources with potential of differentiation in several cell lineages; which present little or no immunogenicity and are an alternative with great importance for storage cell banks. Despite the rising interest, studies for the equine species are still rare. The aim of this study was to isolate, characterize and differentiate mesenchymal stem cells derived from equine amniotic fluid obtained from initial, middle and late third of gestation (AF-MSCs), and compare their results. Twenty three samples from equine amniotic fluid were evaluated by morphological, immunocytochemical and immunophenotypical (Flow cytometer) assays and osteogenic, adipogenic and chondrogenic in vitro differentiation. All samples demonstrated plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The immunocytochemical assay demonstrated cells from all the studied groups were positive for CD44, PCNA and vimentin and negative for cytokeratin and Oct-4. Flow cytometry demonstrated expression of CD44 and CD90 and no expression of CD34, where CD44 and CD90 markers presented decreasing pattern of expression in relation to the gestational development. All samples collected from all gestational phases were capable to differentiate in osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages. Thus, cells obtained from equine amniotic fluid presented morphological and immunophenotypical characteristics and potential of differentiation typical of MSCs showing that the collection can be performed at any stage of pregnancy. However, more studies should be performed about the expression of pluripotent markers as Oct-4 and the differentiation potential for extra mesodermal lineages prior demonstrated in the literature.

Influência da retenção dos anexos fetais no hemograma de fêmeas bovinas da raça Holandesa / The influence of retained fetal membranes on the hemogram of Holstein cows

Analisou-se o hemograma de 177 amostras de sangue de fêmeas bovinas da raça Holandesa nos primeiros 90 dias pós-parto. As amostras foram colhidas de vacas não reagentes ao antígeno (GP 51) do vírus da leucose dos bovinos, distribuídas em dois grupos (I: puerpério fisiológico; II: puerpério com retenção dos anexos fetais) e subdivididas em quatro grupos de acordo com o momento de colheita. Nos primeiros 10 dias após o parto, o eritrograma não sofreu influência da retenção dos anexos fetais. Com a evolução do puerpério, observou-se, nas vacas com retenção dos anexos fetais, anemia de grau leve entre o 10º e 30º dia pós-parto. O leucograma dos animais com retenção dos anexos fetais foi predominantemente linfocitário, caracterizado por leucopenia, neutropenia com desvio à esquerda degenerativo e eosinopenia. A partir do 10º dia após o parto, o leucograma não foi influenciado pela retenção dos anexos fetais.

Hematological profiles of 177 blood samples from Holstein cows were determined during the first 90 days after parturition. Blood samples were collected from cows that were non-reactive to the bovine leukosis virus (GP 51) antigen. The animals were divided into two groups (group I: physiological puerperium and group II: puerperim with retained fetal membranes), and subdivided into four groups, based on the time that the samples were collected. During the first 10 days after parturition, retained fetal membranes did not influence the erythrogram. However, with the evolution of the puerperium period, a mild anemia was observed from the 10th to the 30th day postpartum in cows with retained fetal membranes. The leukocyte profile was predominantly lymphocytic, characterized by leucopenia induced by neutropenia with a left degenerative shift and eosinopenia. From the 10th day postpartum, the retained fetal membranes did not influence the leukogram.